Am 31. Oktober 1517 schickte der Theologieprofessor Martin Luther an den Mainzer Erzbischof einen Brief mit 95 Thesen, in denen der Missbrauch des Ablasshandels stark kritisiert wird. Dieser Tag wird daher allgemein als Beginn der Reformation im Heiligen Römischen Reich deutscher Nation angesehen.
Bis heute umstritten ist, ob Luther die Thesen auch an die Schlosskirche in Wittenberg genagelt hat. Unumstritten hingegen sind die Wirkung und die langfristigen Folgen, die sich später daraus ergeben haben.


Martin Luther auf einem Ölgemälde von Lucas Cranach dem Älteren (1529)
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Zu diesem Zeitpunkt saß noch Maximilian I. auf dem römisch-deutschen Thron. Er sollte von den Auswirkungen der Reformation aber nicht mehr allzu viel mitbekommen, da er im Januar 1519 verstarb, nachdem er bereits vier Jahre lang einen Sarg mit sich herum führen lies.
Sein Nachfolger wurde Karl V., ein Enkel Maximilians, und als Habsburger verfechter des katholischen Glaubens. So war es nicht verwunderlich, dass er mit einem Erlass vom 8. Mai 1521 (Wormser Edikt) die Reichsacht über Luther verhängte und seine Lektüren und Schriften verbot. Des Weiteren sollte er in Rom ausgeliefert und seine Beherbergung verboten werden. Allerdings konnte sich der Erlass nicht im ganzen Reich durchsetzen und Luther wurde im Auftrag des Sächsischen Kurfürsten auf die Wartburg in Sicherheit gebracht.

Anfang 1531 gründeten protestantistisch gewordenen Fürsten den Schmalkaldischen Bund um sich gegen die Politik von Karl zu wehren. Der Bund gewann in den folgenden Jahren mehr und mehr Anhänger, musste sich aber schließlich, im Schmalkaldischen Krieg von 1547 bis 1548, den Truppen des Kaisers geschlagen geben und wurde aufgelöst.
Die Religiöse Einheit konnte Karl aber nicht wiederherstellen, weswegen der langanhaltende Konflikt mit dem Augsburger Reichs- und Religionsfrieden von 1555 endgültig ausgeräumt werden sollte. Dort wurde die Koexistenz beider Konfessionen garantiert und das Zusammenleben von Protestanten und Katholiken wurde rechtlich geregelt. Unter anderem heißt es in dem Dokument: "wessen Gebiet, dessen Religion" (cuius regio, illius religio), womit der jeweilige Landesherr über den Glauben seiner Untertanen zu bestimmen hatte.
Der Augsburger Reichs- und Religionsfrieden gilt als eines der wichtigsten Dokumente des Heiligen Römischen Reiches und läutete eine Friedensperiode zwischen den Religionen ein, die über 60 Jahre Bestand haben sollte.

Nur ein Jahr später verstarb Karl, und sein Bruder Ferdinand, der ihn schon in der Vergangenheit des Öfteren vertrat, wurde zum alleinigen König.
Im Gegensatz zu seinem Bruder beschränkte Ferdinand I. seine Herrschaft auf Deutschland und konnte so die Reichsstände (Mitglieder des Reichstages) enger an das Kaisertum binden. Man spricht hier auch vom Beginn des Neuzeitlichen Kaisertums.
Lange herrschte Ferdinand aber nicht, da er schon im Jahre 1564 verschied.

Nachfolger wurde diesmal, mit Maximilian II., der Sohn des verstorbenen Königs. Er neigte vor seiner Krönung durchaus der protestantischen Lehre zu, weswegen sein Vater ins Testament schrieb:

" ... Gott weiß, daß mir auf Erden kein größeres Leid noch Bekümmernis vorfallen könnte, als dass Ihr, Maximilian, mein ältester Sohn von der Religion abfiele."

Maximilian beugte sich schließlich seiner Familie und legte seinem Vater noch vor dessen Tod ein Treuegelöbnis ab welches besagte, dass er in der katholischen Kirche bleiben würde.
Während seiner Amtszeit wurde er aber vom Papst für seine gemäßigte Religionspolitik kritisiert die es zuließ, dass sich der Protestantismus weiter ausbreiten konnte. Maximilians Zeit als Herrscher war aber ebenfalls relativ kurz, da er bereits 1576 starb und das Zepter an seinen Sohn Rudolf weiterreichte.

Rudolf II. sollte wieder eine etwas längere Amtszeit zuteilwerden, die aber auch im Zeichen der Reformation stand. In den Jahren seit dem Augsburger Frieden hatte sich im Heiligen Römischen Reich die Konfessionalisierung stark entwickelt, was bedeutet, dass sich die verschiedenen Konfessionen stark gefestigt und voneinander abgegrenzt hatten. Dies führte ab den 1580er Jahren zu starken Spannungen innerhalb des Reiches, da die staatlichen Institutionen durch die gegensätzlichen Meinungen blockiert wurden. Das Reichskammergericht war ab dem Jahre 1588 komplett handlungsunfähig.
Kaiser Rudolf gelang es in dieser Zeit nicht zwischen den Konfessionen zu vermitteln und zeigte insgesamt nur wenig Initiative in der Reichspolitik. Die Protestanten hielten ihn für parteiisch und lehnten sich in der Folgezeit stärker an Frankreich und England an, während die Katholiken auf Spanien setzten.
Auf dem Reichstag von Regensburg im Jahre 1608 kam erstmals keine Einigung zwischen den Konfessionen zustande, was dazu führte, dass auch dieses Reichsorgan seine Handlungsfähigkeit verlor.
Am 14. Mai 1608 wurde von reformierten Fürsten die Protestantische Union, und als Gegenreaktion von katholischen Fürsten am 10. Juli 1609 die katholische Liga, gegründet. Nur ein Jahr später bereitete der französische König einen Truppeneinfall im niederländischen Reichsteil vor um den protestantischen Fürsten zur Hilfe zu kommen. Nur ein Attentat kurz vor seiner geplanten Abreise verhinderte vermutlich, dass es schon 1610 zu einem großen europäischen Krieg kam.

Die Krise im Reich führte schließlich dazu, dass sich Rudolfs Bruder (Erzherzog Matthias) und andere Habsburger gegen ihn wandten und ihn faktisch entmachteten. Am 23. Mai 1611 ließ sich Matthias zum König krönen und duldete Rudolf nur noch als machtlosen Kaiser bis dieser schließlich im Jahre 1612 verstarb.
Ändern konnte aber auch Matthias nichts mehr an der gefährlichen Entwicklung im Reich und da er schwer an Gicht erkrankte zog er sich nach Wien zurück. Auch die Regierungsstellen wurden ab 1612 Stück für Stück von Prag nach Wien verlagert, was es noch schwieriger Machte die Geschehnisse in Böhmen zu beeinflussen. So kam es, dass die protestantischen Stände in Böhmen die katholische Politik nicht mehr hinnehmen wollten und am 23. Mai 1618 die königlichen Statthalter und den Kanzleisekretär aus dem Fenster der Prager Burg warfen.
Obwohl alle Opfer den Sturz überlebten war dies der Auftakt zur schlimmsten und größten Katastrophe die Europa bis dahin erlebt hatte: Dem Dreißigjährigen Krieg.